接触痕是法医实践中最常见的微量样本种类之一，在此※前的文章中，我们介绍了法医科学家们对接触DNA来源探索的部分努力（脱落细胞？接触DNA从哪里来？）。但受限于当时的技术水平，以形态学为主的研究限制了结果的适用范围和说服力。近年来，成熟的现代生物学技术越来越多←的在法医学领域得以应用，而法医科学家们也始终没有忽视对于接触痕、脱落细胞的进一步探索。2020年，伦敦国王学院的研究团队发表题为Illuminating touch deposits throughcellular characterization of hand rinses and body fluids with nucleic acidfluorescence的文章，通过流式细胞术和显微镜观察，研究了手部接触脱落№物的组成。

 

根据前人的文献，接触DNA的来源可能十分多样化：一方面，尽管脱落的角质细胞不含细胞核，但细胞外↓仍可能有游离的DNA的存在；另一方面，碎片化、降解的细胞也可能释放游离的细胞核；最后，接触脱落物也可能并非源自手上，而是手与其他更丰富的有核细胞源（如鼻子，眼睛或嘴巴）接触后积累在手上的。多样的来源』使得实际样本过于复杂、不可控，因而本次研究选取了5种受控的单一来源模拟接触脱落物：

 

未洗过的手：志愿者用无菌PBS轻轻擦洗未清洗过的手，每次2ml，共6ml。将擦洗后的液体收集在无菌称量皿中，并转移至1.5ml离心管中。

 

洗过的手：志愿者用肥皂洗手，并在自来水中彻底冲洗1-2分钟，然后避免接触，风干。重复上一类样品的收集流程。

 

唾液：志愿者在收集前至少1小时不吃不喝，用水短暂漱口后让唾液在嘴中积聚几分钟。这样做是为了最大程度地减少刮擦的颊细胞，而将收集的重点放≡在最有可能出现在可转移唾液中的细胞上。随后在无菌称量皿中收集3ml唾液，并用3mlPBS稀释。

 

鼻腔灌洗液：志愿者使用无菌一次性移液器，将每次2ml总共6ml的PBS加入自己的鼻∏腔（两个鼻孔）中，在研究人员的指◥导下进行鼻灌洗。在液体离开鼻腔、与外部皮肤接触之前，将其收集在无菌称量皿中。

 

洗眼液：志愿者使用无菌洗眼杯，用每次2ml总共6ml的PBS洗睁▂开的右眼，收集液体转移到1.5ml离心管中

 

将每种样品用以下每种条件染色：噻唑橙（TO，84nmol/L），碘化丙啶（PI，2.15μmol/L），DiamondDye（DD，1X），组合的TO/PI（84nmol/LTO，2.15μmol/LPI）。TO是一种可渗透细胞的花青染料，而PI则不会渗透到活的、完整的细々胞中。两者∩都将在核酸结合后发出荧光，并广泛用于显微镜和流式细胞仪中。一起使用时，可以区分活细胞和死细胞，或完整细胞和受损＠ 细胞。DD是一种DNA结合染料，用于检测电泳凝胶中的核酸。

图1. 在流式细胞仪上单个样本的每种样品类型的FSC v. SSC图。X轴表示前向散射（大小），Y轴表示侧向散射（粒度）。大小按色彩分类（绿色：6μm以下，粉红色：6–10μm，蓝色在10-15μm，红色：在15μm以上）。

所有样品类型均◆显示出高密度的小、低粒度事件，说明有大量碎片；然后是分布更大的大粒度事件，反映完整的细胞。图1可见接触脱落物中，既有完整细胞大小（15–50μm），也有更小的（通常低于10μm）细胞碎片、体液中的游离细胞核、白细胞等。

 

图1中唾液、洗∮过的手和未洗过的手都包含相对较大的细胞群，而洗√眼和洗鼻样本的大型细胞数量较低，且总体细胞密度较低，这可能是由于收集这些样品时缺乏摩擦所致。而同样摩擦少的唾液细胞密度更高，可能表明口腔粘膜比鼻子或眼睛更▃容易脱◥落细胞。

 

总体而言，单一样本的细胞分布差别不够大，不足以通过细胞分布来▲揭示复杂的脱落沉积⊙物的主要来源。

                                                                                                图2. 同一名志愿者5天中洗过的手样本的FSC v. SSC图。

                                                                                                     图3. 6名志愿者洗过的手样本的FSC v. SSC图。

为了评估每日变化对每个被检查的体液中单个细胞脱落的影响，在5天中分别采样，所有样本没有显著差异（p>0.05）。而在不同个体中，大于15μm的大细胞事件的百分比范围从7.4％至57.2％，任何两个▓捐赠者的大细胞群体百分比之间的最大差异平均值为30.9％，这比每个个◥体中最大差异的平均值高18.9％，但仍没有达到统计学显著差异（p=0.12）。

 

使用荧光核酸染料来定位样品中的DNA，即确定哪些大小的细胞或片段包含遗传物质。荧光强度高于未染色对照样品的↘测量自身荧光强度的任何↓颗粒或细胞即认为是“ DNA（+）”，因为它们的荧光表明存在核酸。

图4. PI染色的唾液的FSC v. SSC图（左上）显示了角质形〓成细胞簇（>15μm）和白细胞/碎片（<10μm）。红色表示检测到的核◢酸荧光高于黑色（左下）所示的自然自发荧光水平。特写（右）显示唾液中存在DNA+事件，与白细胞、保留DNA的降解细胞或游离核一致。

图5. 左：PI染色的洗过的手样本的FSC v. SSC图（左上）显示角质形成细胞簇（>15μm）和白细胞/碎片（<10μm）。红色表示⌒　检测到的核酸荧光高于黑色（左下）所示的自然自发荧光水平。特写（右）显示很少的DNA+事件。

右：未洗过的手样本的分布和荧光图相同。特写（右）显示出↑有限的含核酸碎片，比唾液中可观察到的碎片要少■得多，比洗过的手ζ样本多。

所有样本都做了核酸染色，其中洗过的手对接触脱落物的含量信息最多，而唾液有望包含全部潜在的DNA来源（即完整的有核细胞，无核角质细≡胞，小白细胞，游离核和降解的细胞片段）。

 

对于唾液样本，TO不仅染色了角质形成∏细胞（>15μm），还对大部分小细胞/碎片（6-15μm）进行了染色，这可能是由于存在大量白细胞。PI染色则表明大多数细胞被破坏且含有DNA。

 

而对→于洗过的手样本，其DNA+几乎完全位于大细胞大小区域中。在PI或TO染色的小细胞/片段大小范围内几乎没有DNA+事件发生（图5）。这表明洗手液中游离核或含有DNA的细胞碎片的发生率受到限制。

 

有趣的是，在洗过的手和未洗过的手中都观察到了相似的结果，表明】手上并没有积累很多富含DNA的生物材料，接触DNA实际上可能是无细胞的游离DNA或由完整的细胞（如无核角质细胞）提供。

图6. 六◥种样品类型（从上至下：洗手、未洗手、唾液、洗鼻液、洗眼液，阳性对照：培养的角质形成细胞）用三种核酸染料染色（从左至右：碘化丙啶，噻唑橙、DiamondDye）。样品以200×检查。比●例尺代表30μm。

显微镜观察洗过的和未洗♀过的手样本显示╲出大量的双荧光无核角质细胞，它们也存在于唾液中，很少出现在洗眼液和洗鼻液中。有核上皮细胞□仅在唾液中完全可见。鼻腔灌洗显示偶有角质细胞和一些不∞规则的荧光，可能是具有弥散性核酸的粘液；在两个样品中，DiamondDye观察到小的明亮的白细胞。洗眼液包含的细胞很少（与流式∮细胞术一致），仅包含稀有的荧光◆颗粒。当在洗眼液和洗鼻液中看到荧光时，它通常是很小的颗粒或广泛的低强度涂片，而不是可识别的细胞。

 

在显微镜下观※察到的任何角质细胞中都缺乏核，然而这些无核细胞确实对多种核酸染料的DNA呈阳性。脱落的角质细胞的角质包膜似乎不能防止PI染色。这可能是因为角质细胞死亡并脱落，因此它们的膜是可渗透的。另一种可能性是，角质细胞的卐核酸染色反映了小的、膜结合的DNA片段的存在，这些片段可能是从汗』液中存在的游离DNA中结合的。

流式细胞术的数据和显微镜观察到的角质细胞中的DNA+染色结果，揭示了无核细胞含有大量DNA。终末分化期，间核和其他细胞器（尤其是包含DNA的线粒体）的降解可能会在角质细胞内留下残留的核酸。需要注意的是△，这些DNA和无细胞游离DNA一样，可能存在高度片段化的情况，对于▽标准法医STR完整扩增贡〖献有限，但其丰富的含量完全值得通过其方法（例如SNP）加以利用，使其成为接触DNA证据有价值的附加来源。

 

流式细胞术在小细胞/碎片大ζ　小的数据表面，尽管碎片是接触脱落物中占据较大比例，但它并不包含】大量的DNA阳性碎片细胞或游离核。尽管在显微镜下检查的样本可◥能没有捕获到所有DNA（+）细胞片段，但这些○数据表明碎片对接触沉积物的DNA含量贡献有限。因此，在DNA提取中过滤、除杂的过程【中，即使将分离尺径缩小至6-15μm也几〗乎不会增加DNA损失的风险。

 

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.fsigen.2020.102269